中国药典2015年版四版规定干扰素生物活性检定的方法什么

饶春明，王军志( 中国食品药品检定研究院，卫生部生物技术产品检定法及其标准化重点实验室，北京 100050)

摘要:2015 年版《中国药典》已出版，为更好地了解和执行2015 年版《中国药典》，笔者首先简要回顾了2010 年版《中国药典》 在出版后的生物技术药质量控制执行情况，列举了相关问题，说明及时学习和了解2015 年版《中国药典》及相关文件的必要 性。然后依据各相关法规和2015 年版《中国药典》三部对与生物技术药质量控制密切相关的内容进行介绍，内容包括:质量标准 研究依据及法规要求;凡例以及凡例第二十六条对标准品、参考品、对照品等标准物质的相关规定;生物制品通则以及与生物技 术药生产与质量控制密切相关的6 个规程;人用重组 DNA 技术产品总论和人用重组单克隆抗体产品总论;各论以及以我国2013 年度评价性抽验注射用重组人干扰素 α2a 为例分析检定规程相关内容;检测方法通则以及新增附录干扰素生物学活性测定法第 二法( 报告基因法) 。讨论分析了2015 年版《中国药典》收载的产品各论制造与检定规程的优缺点以及当时制定质量标准时的 法规与技术背景;重点讨论了肽图分析在重组产品蛋白质结构分析以及生产工艺稳定性评价方面的重要性，新增人用重组 DNA 技术产品总论部分关键性技术要求，液相质谱等新技术在生物技术药蛋白质结构分析以及对照品鉴定等方面的应用。 doi:10. 11669/cpj. 2015. 20. 012 中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1001 －2494( 2015) 20 －1776 －06

Introduction of the Related Content of Biotech Drugs Quality Control in the Chinese Pharmacopoeia 2015

RAO Chun-ming，WANG Jun-zhi* ( National Institutes for Food and Drug Control，Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and Standardization of Biotech Products，Beijing 100050，China)

ABSTRACT: The Chinese pharmacopoeia 2015 has been issued. To better understand and implement the new pharmacopoeia，this article first briefly reviews the situation of biotech drugs quality control after the execution of the 2010 edition pharmacopoeia，lists related issues，and illustrates the necessity to study and understand the new pharmacopoeia and related documents in time. Then according to the relevant regulations and the Chinese pharmacopoeia 2015 Volume Ⅲ，the contents of the draft of biotech drugs quality control are introduced，including research basis and regulations of quality standards，the general notice and related provisions of standard materials such as standard，reference，reference substance in the article 26 in the notice，general requirements and six requirements related to the production and quality control of biotech drugs，general monograph of human recombinant DNA technology products and general monograph of human recombinant monoclonal antibody products，the monograph and the China's 2013 annual valuation to sample vial recombinant human interferon alpha 2a as an example analysis for verification regulation related content，and appendices and the second method ( reporter gene method) for determination of interferon biological activity in the new appendix. The advantages and disadvantages of the requirements on products contained in this edition of pharmacopoeia were discussed，as well as the regulations and technical background when the quality standards were formulated. Focus was put on the importance of peptide mapping analysis in the structure analysis of recombinant protein product and the stability evaluation of production process，key technical requirements in new general monograph of human recombinant DNA technology products，and the application of new technologies，such as LC-MS in structure analysis of biotech drugs protein and identification of reference substance，etc. KEY WORDS: Chinese pharmacopoeia; biotech drug; quality control; regulation

2015 年版《中国药典》已经出版并将于12 月 1 日执行。 为了更好地了解和执行 2015 年版《中国药典》 ［1］的相关规 定，有必要对2010 年版《中国药典》 ［1］在出版后的生物技术

药质量控制执行情况做一简要回顾。 根据国家食品药品监督管理局2010 年6 月17 日发布的 “关于实施《中国药典》2010 年版有关事宜的公告( 2010 年第

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Chin Pharm J，2015 October，Vol. 50 No. 20 中国药学杂志2015 年10 月第50 卷第20 期

43 号 ) ” : 《中华人民***和国药典》2010 年版( 以下简称中国 药典) 已由卫生部2010 年第5 号公告颁布，自 2010 年 10 月 1 日起执行。现就实施《中国药典》的有关事宜公告如下。 一、《中国药典》包括凡例、正文及附录，是药品研制、生 产、经营、使用和监督管理等均应遵循的法定依据。所有国 家药品标准应当符合中国药典凡例及附录的相关要求。 二、凡《中国药典》收载的品种，自执行之日起，原收载于 历版药典、卫生部颁布药品标准、国家食品药品监督管理局 颁布新药转正标准和地方标准上升国家标准的同品种药品 标准同时废止。 药品注册标准不符合中国药典有关要求的，药品生产企 业应按《药品注册管理办法》的有关规定提出补充申请。对于 药品注册标准中收载的检验项目多于中国药典规定的或质量 指标高于中国药典要求的，在执行《中国药典》的基础上，应同 时执行原标准的相应项目和指标。 《中国药典》品种项下未收载的制剂规格，其质量标准按 中国药典同品种相关要求执行，规格项按原批准证明文件 执行。 公告第三至第九条可参见原文，不在本文赘述。根据公 告第一条，药典凡例、正文及附录是药品研制、生产、经营、使 用和监督管理等均应遵循的法定依据; 根据公告第二条，药 品注册标准不符合中国药典有关要求的，药品生产企业应按 《药品注册管理办法》的有关规定提出补充申请。然而当时 有许多生物技术药生产企业对此并未引起足够的重视，如新 药研发企业通常只参考药典正文各论某个品种制定其质量 标准，而未对凡例中标准物质的有关规定对其标准物质进行 必要的评价和鉴定，也未对相关蛋白做必要的分析; 一些生 物技术药企业其上市产品的注册标准与2015 年版《中国药 典》比较缺少“渗透压摩尔浓度”和“残余抗生素活性”测定， 但未及时依据2015 年版《中国药典》的要求按《药品注册管 理办法》的有关规定提出补充申请，以至于中检院在对其产 品进行质量评价时缺少符合要求的质量标准。 针对上述但不止于上述问题，国家食品药品监督管理局 药品注册司2011 年1 月10 日给中国食品药品检定研究院和 国家药典委员会印发了“关于印发生物制品实施《中国药典》 2010 年版相关问题研究联席会议纪要的通知( 食药监注函 ［2011］ 3 号) ”。会议经研究相关问题形成相应的处理原则， 其中一条规定:对于已有注册标准，且按照 2010 年版药典三 部相关要求对质量标准或检验方法进行修订并向省局备案的 品种，检验时对质量标准的登记方式应为企业原注册标准号 以及相应的省局备案号，以确保该产品质量标准的唯一性。 该通知临时解决了一些生物技术药质量标准的相关问 题，但如何备案，各省市药监局各不相同，一些备案件内容完 整规范，而另一些备案件内容不够充分，如渗透压摩尔浓度 未规定范围，以至于不能确保该产品质量标准的唯一性，在 企业委托中检院对其产品进行质量评价时还需按相关要求 重新备案。 为了避免类似上述问题的再次发生，生物技术药研究单

位、生产企业和质量监督管理部门有必要认真学习、了解和 掌握2015 年版《中国药典》的内容和配套出台的相关文件， 并做好相应准备，确保在 2015 年版《中国药典》执行之日起 能满足药典的各项要求。本文依据各相关法规和2015 年版 《中国药典》三部对与生物技术药质量控制密切相关的内容 进行介绍。

1 质量标准研究依据及法规要求 1. 1 国内法规 主要包括《中国药典》 ［1］ 、《药品注册管理办法》附件 3 ( 生物制品注册分类: 治疗用生物制品 ) 、《人用重组 DNA 产 品质量控制技术指导原则》 ［2］ 、《人用单克隆抗体质量控制 技术指导原则》 ［3］ 、《人基因治疗研究和制剂质量控制技术 指导原则》、《药品生产质量管理规范》、《进口药品注册检验 指导原则》、《生物类似药研发与评价技术指导原则( 试行) 》 等，这些法规从不同角度对生物技术药质量控制做出规定， 是我国生物技术药质量标准研究的重要依据。 1. 2 国际法规 主要包括美国食品药品管理局( FDA) 、药品注册的国际 协调组织( ICH) 等颁布的指导性法规和文件、欧洲及美国药 典等，这些法规有较好的前瞻性，可作为参考，如 siRNA、反 义核酸药物的研究目前我国还未制定相应的技术指导原则， 部分技术问题可参考国际相关法规制定质量标准。

2 2015 年版《中国药典》三部 2. 1 凡例 凡例是正确使用《中国药典》进行质量检定的基本原则， 是对《中国药典》各论品种正文、生物制品通则、总论、检测方 法通则( 简称通则) 及质量检定有关的***性问题的统一规定。 凡例第二十六条对标准品、参考品、对照品等标准物质做出 明确规定。 国家生物标准品及生物参考品，系指用于生物制品效价 或含量测定或鉴别、检查其特性的标准物质，其制备与标定 应符合“生物制品国家标准物质制备和标定规程”要求，并由 国家药品监督管理当局指定的机构分发。企业工作标准品 或参考品必须经国家标准品或参考品标化后方能使用。 对照品，系指用于生物制品理化等方面测定的特定物 质。除另有规定外，均按干燥品( 或无水物) 进行计算后 使用。 2010 年版《中国药典》凡例有上述同样的规定［1］，并规 定对照品须由国家药品检定机构审查认可，但未规定如何审 查认可对照品，本版药典则新增了“人用重组 DNA 技术产品 总论”，对用于生物技术产品理化等方面测定的对照品的分 析鉴定做出了明确规定。 2. 2 生物制品通则 通则是对正文生产和质量管理规范的原则性要求。 2015 年版《中国药典》修订收入了2010 年版7 个规程，包括: 生物制品生产检定用菌毒种管理规程、生物制品国家标准物 ·1777·中 国药学杂志2015 年10 月第50 卷第20 期 Chin Pharm J，2015 October，Vol. 50 No. 20

质制备和标定规程、生物制品分装和冻干规程、生物制品贮 藏和运输规程、免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程、血液 制品生产用人血浆、生物制品生产和检定用动物细胞基质制 备及检定规程; 新增了 1 个规程: 生物制品生产用原材料及 辅料的质量控制规程。 除免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程、血液制品生产 用人血浆以外，其余6 个规程均与生物技术药质量控制密切 相关，应加以关注和了解。研究单位在研制创新生物技术药 时，如果生物学活性测定还没有相应的国家标准品或国际标 准品，应参照版本药典生物制品国家标准物质制备和标定规 程研制标准品。因为是首批标准品，不论是国家标准品还是 企业标准品，均必须保证标准品长期稳定，因此首先应进行 标准品配方、冻干工艺研究和稳定性评价，确保候选标准品 稳定后开展相应的协作标定。 2. 3 总论 总论是对某一类别生物制品生产及质量控制的通用性 要求。2015 年版《中国药典》修订了 2010 年版《中国药典》 的1 个总论:微生态制品总论; 新增了 3 个总论，包括: 人用 疫苗总论、人用重组 DNA 技术产品总论、人用重组单克隆抗 体产品总论。后两个总论与生物技术药相关，是在充分了解 国内外先进生物技术药技术研究进展，参考国内外相关法 规［2-8］的基础上制定出来的，并采纳许多新技术在质控关键 项目方面的研究成果，与 2010 年版《中国药典》正文中生物 技术药各论的具体情况比较，更具有先进性和前瞻性，而且 涵盖内容更加广泛，对创新生物技术药的生产和质量控制具 有重要指导作用。一般的生物技术药必须满足人用重组 DNA 技术产品总论的相关要求;重组单抗制品同时还必须满 足人用重组单克隆抗体产品总论的相关要求。本文以人用 重组 DNA 技术产品总论为例进行介绍。 人用重组 DNA 技术产品总论由概述、制造、质量控制、 贮存、有效期和标签几部分组成。对生物技术药的生产与质 量控制提出了通用性技术要求，因篇幅有限，本文在简要介 绍总体内容的基础上，仅选择部分关键性质量控制技术要求 进行详细介绍。 制造部分包括基本要求、工程细胞的控制、生产过程控 制、生产工艺变更等技术要求。其中工程细胞的控制涉及: 表达载体和宿主细胞、细胞库系统、细胞库的质量控制、细胞 基质遗传稳定性等内容;生产过程控制涉及: 细胞培养、有限 传代水平的生产、连续培养生产、提取和纯化、原液、半成品、 成品制剂等内容。 质量控制部分包括:特性分析、产品检定、包装及密闭容 器系统等技术要求。其中特性分析包括: 理化特性( 一级结 构、糖基化修饰、高级结构) 、生物学活性、免疫化学特性、纯 度和杂质( 产品相关物质/杂质、工艺相关杂质、污染物) 、含 量、参比品等内容; 产品检定包括: 鉴别、纯度和杂质、效价、 含量、安全性试验、其他检测项目等内容。 总论第“3. 1. 1. 1”条对生物技术药的蛋白质一级结构提 出技术要求:一级结构，即包括二硫键连接方式的氨基酸序

列。应尽可能采用综合的方法测定目标产品的氨基酸序列， 并与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较。氨基酸 序列测定还应考虑可能存在的N 末端甲硫氨酸( 如大肠杆菌 表达的产品) ，信号肽或前导序列和其他可能的 N、 C 末端修 饰( 如乙酰化，酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解等) ， 以及各种可能的翻译后修饰( 如 N 端焦谷氨酸化、脱酰胺化， 氧化，异构化，碎片化，N-连接和 O-连接的寡糖，糖基化，聚合 等) 。同时还应测定游离巯基和二硫键，并对二硫键的完整 性和正确性进行分析。 总论第“3. 1. 1. 2”条，糖基化修饰，应对糖基化修饰进行 全面的分析和确定。如糖基化修饰与制品半衰期和生物学活 性相关，则应确定糖的含量( 如中性糖，氨基糖和唾液酸) 。糖 型结构( 如非人源的糖型结构) 可能与不良反应相关，应尽可 能对多肽链的糖基化位点以及糖链的结构、糖型等进行分析。 总论第“3. 1. 6”条，参比品，应选择已证明足够稳定且适 合临床试验的一个或多个批次作为参比品，用于鉴别、理化 和生物学活性等各种分析，并应按“特性分析”要求进行全面 分析鉴定。参比品的建立和制备可参照“生物制品国家标准 物质制备和标定规程”进行。 用于生物技术产品理化等方面测定的对照品，如用于生 物技术药肽图或等电点测定的对照品，可用原液直接分装制 得，一般 －70 ℃以下保存。根据重组产品特性应进行必要 的分析鉴定，内容包括: 蛋白质含量、比活性、等电点、纯度、 N-末端氨基酸序列、质谱相对分子质量、液质肽图、二硫键分 析、糖基分析( 真核表达) 等。该段落不仅对鉴定项目做出了 必要的规定，而且对其生产和保存提出合理建议。这些鉴定 项目，除相应原液已有的与纯度和结构相关的检定项目以 外，还增加了质谱相对分子质量、液质肽图、二硫键分析等关 键性鉴定项目，从而确保对照品与理论预期相一致。用原液 直接分装制得的对照品其缓冲液成分与原液的完全一致，可 确保肽图分析和等电点测定产品与对照品图谱的可比性; 对 照品保存在 －70 ℃以下使得保存温度远低于溶液***融点从 而避免了反复冻融，一般情况下可长期保持稳定。 总论第“3. 2. 3”条，效价，效价测定是以产品生物学特性 相关属性为基础的生物学活性定量分析，原则上效价测定方 法应尽可能反映或模拟其作用机制。比活性( 每毫克产品具 有的生物学活性单位) 对证明产品的一致性具有重要的价 值。应采用适宜的国家或国际标准品或参考品对每批原液 和成品进行效价测定。尚未建立国际标准品/国家标准品或 参考品的，应采用经批准的内控参比品。标准品和参考品的 建立或制备应符合中国药典“生物制品国家标准物质制备和 标定规程”。 2. 4 正文 正文系根据生物制品自身的理化与生物学特性，按照批 准的原材料、生产工艺、贮藏运输条件等所制定的、用以检测 生物制品质量是否达到用药要求并衡量其质量是否稳定均 一的技术规定。治疗用生物制品正文内容按顺序可分别列 有: ①品名( 包括中文通用名称、汉语拼音与英文名) ; ②定

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义、组成及用途; ③基本要求; ④制造; ⑤检定( 原液、半成品、 成品) ; ⑥保存运输及有效期。 2015 年版《中国药典》在治疗性生物技术药方面，修订 收入了2010 年版《中国药典》33 个各论，取消了1 个各论;新 增了 5 个各论，其中 2 个来自 2010 版第二增补本( 表 1) 。 “注射用抗人 T 细胞 CD3 鼠单抗”被取消，主要是因为其质 量标准与新增的“人用重组单克隆抗体产品总论”比较差距 较大，而且是鼠源性单抗，不是今后人用重组单克隆抗体药